Gélszűrési oszlopokat használnak külön fehérjék komplex elegyek . Mivel minden egyes egyedi fehérje molekulatömege , akkor lehet , hogy indukált válnak szét megkülönböztethető rétegekre a vándorló őket egy oszlopon szűréssel tartalmazó gél mátrixban egyenletesen elosztott . A helyesen azonosítani minden fehérje, amely külön ki , akkor kell kalibrálni az oszlopok segítségével több fehérjék ismert molekulatömegű weight.Things amire szüksége van
Karboanhidráz
citokróm C
Aprotinin
Basal salt
Centrifugacsövek
ferritin
Centrifuga
Pipet szivattyú
250 ml-es mérőhengerbe
Buffer folyadék
Tudományos törlőkendő
fecskendőt
Show More utasítások
1
Vegye ki az üveg karboanhidráz , citokróm C és aprotinin a hűtő vagy a fagyasztó , és lehetővé teszik számukra, hogy elérje a szobahőmérsékletet . Adjunk hozzá 4 mg fehérje mindegyik egy centrifugacsőbe milliliterenként gél a szűrési oszlopban. 961 ul hozzáadása bazális só per milligramm fehérje minden centrifuga csőbe , hogy feloldja a fehérjék. Add 39.2 MCL ferritin milliliterenként gél minden csövet, majd keverjük össze a centrifugában .
2
Kapcsolja ki a szűrési oszlop szivattyút és zárja a csapot az oszlop bejáratánál . Csavarja ki , de ne távolítsa el , a tetején a szűrés oszlopban. Állítsa be a szivattyút a maximális áramlási sebesség az oszlop , és indítsa újra a szivattyút, amíg a puffer anyagot állítottak ki . Állítsa le a szivattyút .
3
Adjunk hozzá 1 ml-t mindkét fehérje a szűrés oszlopra a pipetta szivattyút . Csöpög le a fehérjéket az oszlop belsejében a magassága egy 1 cm-es és 2 cm-es , a munka a belső széle körül az oszlop. Hagyja, hogy a protein keveréket , hogy rendezze a tetején a gél-mátrix .
4
Helyezze a kivezető csövet a szivattyú egy tiszta , száraz, 250 ml-es palack . Indítsa újra a szivattyút ütemben 0,30 ml percenként, és futtatja a fehérjéket a gél mátrixba. Míg a szivattyú működik , öblítsük ki a cső oldalán a pipetta használatával a szivattyú és egy kis mennyiségű folyadék pufferben . Ha a fehérjék teljes belépett a gél-mátrix , csökkenti a szivattyú sebességét 0,02 ml percenként és a szivattyú egy 5 cm 7 cm-es réteg puffer folyadék tetején a mátrix .
5
Húzza ki a oszlop kupakot a csapot . Tisztítsuk meg az oszlop sapkát és a belsejében az oszlop a tudományos tisztító törlőkendők . Tegye vissza az oszlop sapkát. Töltse fel a puffer tartályt pufferrel folyadék. Csatlakoztassa a fecskendőt , hogy a csapot, és nyissa meg. Használja a fecskendőt , hogy rajzoljon egy kis mennyiségű pufferben és a csövön keresztül a fecskendőbe. Zárja el a csapot, és helyezze vissza , hogy az oszlop tetején. Nyissa ki a csapot, és ellenőrizze a szivárgást .
6
Fuss az oszlopon, 0,02 ml percenként néhány napig, amíg a ferritin banda közeledik a vége az oszlop. Gyűjtsd össze az összes szűrési gélt , hogy szivattyúzzák ki a mérőhengerben .
