glutation , vagy a GSH , egy nem esszenciális tripeptid készült cisztein , glutaminsav és a glicin . Ez egy erős antioxidáns, amely védi a sejteket és a szervek a szervezetben a káros hatásait ROS , vagy reaktív oxigén gyökök , amelyek úgy vannak kialakítva , mint a molekuláris oxigén hatására a különböző anyagcsere- folyamatokat a szervezetben . Antioxidánsok , mint például a glutation , a ROS semlegesítésére , és megakadályozzák őket abban, kölcsönhatásban és károsítja a DNS-t és fehérje a sejtekben. Az arány az oxidált és redukált formáját GSH a szervezetben jelzi a ROS kapcsolatos oxidatív stressz a body.Things amire szüksége van
Fecskendő
szárnyas tűt
Centrifuga
nátrium heparin
Freezer
Szulfoszalicilsav
GSH Reaction Agent
Microplate
Fényforrás
GSH standard oldat
Show More utasítások
1
Döntetlen körülbelül 2 ml vért a vénából a véna anticubetal egy 23 -as méretű tűt pillangó csatolt egy 5 ml-es fecskendő . Adjuk hozzá a minta tesztelésére nátrium-heparint tartalmazó csövekbe , és finoman fordítsa a csövet a keveréshez.
2 Gyűjtsük össze a vörös vérsejteket centrifugálással a mintát 2500 fordulat percenként öt percig. Hó és latyak a mintát háromszor megtörni a sejteket. Centrifugáljuk a sejtlizátum oldatot 10 percig 12000 rpm- és 4- fok, és a felülúszót gyűjtsük össze .
3 Vegye ki a fehérjét a mintából 5 százalék hozzáadásával szulfoszalicilsav és a minta centrifugálása 12,000 rpm fordulaton, öt percig 4 fok. Tárolja a fehérjementesített felülúszót -112 fok .
4
Mix tiol felismerés ügynök , GSH -reduktáz , nikotinamid -adenin-dinukleotid -foszfát és vizsgálati puffer arányban jelezték a készlet gyártójának , hogy a GSH elegyet . Az egyes kémiai függ a vizsgálatok számát kíván végrehajtani . Hígítsuk a GSH reakcióelegyet 5 százalék szulfoszalicilsavval kap koncentrációk 16 , 32 , 63 , 125, 250 és 500 mikroliter .
5
hozzáadása 1-10 mikroliter fehérjementesített a vérminta a lyukakba egy mikrolemez . GSH hozzáadása sorozatban hígított standard oldat , amely rendelkezésre áll a vizsgálati készlet, minden egyes üreghez , hogy a teljes térfogat minden egyes lyukban 10 mikroliter . Matton 6
hozzáadása 90 mikroliter reakcióelegy GSH , amit tett 4. lépésben az egyes lyukakhoz a mikrolemez . Keverjük össze a reagens rázással a lemezt 30 másodpercig.
7
Mérjük meg azonnal helyezze a lemezt fény hullámhossza 405 és 415 nanométer . Inkubáljuk a lemezt 30 percig. Vegye abszorbancia értékek után minden öt percben a lappangási .
8
Hígítson 6. millimoláris A feldolgozott mintából 5 százalék szulfoszalicilsavval és trifluormetánszulfonsavval szulfonát megoldást. Ez eltávolítja az összes redukált GSH az oldatból . Hozzáadás 1-10 micoliters ennek az oldatnak a mikrolemez üregeibe , és ismételje meg az 5., 6. és 7. . Ez segít megbecsülni az oxidált GSH mennyiségét a mintában. Matton 9
Ábrázoljuk az abszorbancia és a minta koncentrációban egy grafikonon megszerezni a GSH görbét mind redukált és oxidált glutation. Számítsuk ki a két forma közötti arány GSH . Emelkedett oxidatív GSH szint jelzi az oxidatív stressz és a ROS .
