A patch- clamp kísérlet mérésére egyetlen élő sejteket. Teszi ezt egy nagyon finom pipettával tartott szoros ellen egyetlen sejt membrán ( a külső védőréteg ) . A megnyitása a pipetta csak körülbelül 1 mikron (egy ezred milliméter ), és szabályozható optikai mikroszkóppal . A sejteket egyenletes tartják egy edénybe detacher sejt használatával , mint például a tripszin . Egy specifikus sejt választanak, és a pipetta hegyét kerül a sejtmembránon. Egy tömítés alkalmazásával van kialakítva szívó és részben a membrán belekeveredik az , amire szüksége van pipette.Things
Cell lemez
Foszfát pufferolt sóoldatot, vagy PBS-ben ( kalcium és magnézium nélkül ) photo Tripszin
Inkubátor
10 ml-es pipetta
HEK ( humán epidermális keratinocyctes ) közepes
magzati borjú szérumot ( FCS)
Centrifuga
Külső rögzítési megoldás
Patch clamp chip
Twist sapka
Elektróda
Show More utasítások
1
Szerezzen be egy lemezt a sejteket. Mossuk a lemezt két alkalommal 10 ml PBS-sel (foszfáttal pufferolt sóoldat ), anélkül, kalcium és magnézium. Adjunk hozzá 2 ml detacher ( tripszin ) . Inkubáljuk a lemezt három percig 37 Celsius fok. Vizsgáljuk meg a lemezt a mikroszkóp alatt , hogy biztosítsa , hogy a sejtek már levált. Óvatosan mozgassa a lemezt, hogy az összes sejtek leválnak aljáról a lemez. Adjunk hozzá 10 ml HEK ( humán epidermális keratinocyctes ) és az FCS ( magzati tehén szérum) közegben. Használjon 10 ml-es pipetta , hogy mozog a sejteket fel-le .
2
Figyelje meg a sejteket a mikroszkóp alatt annak érdekében, hogy azok egyetlen sejt . Pipetta segítségével pipettával 10 ml-es , amíg a sejtek egyetlen, ha szükséges. Centrifugáljuk a sejteket két percig 1000 percenkénti rotációk . Dobja ki a felülúszót . Helyezzük a sejteket 10 ml magzati borjú szérumot. Centrifugáljuk a sejteket ismét két percig 1000 percenkénti rotációk . Dobja ki a felülúszót . Helyezze a sejteket 200 mikroliter felvevő megoldás. Vegye figyelembe a sejtek mikroszkóp alatt egyszeri sejtek sima membránnal .
3
Helyezze a sóoldat belül patch clamp chip. Hozzáadása egy csepp intracelluláris elektrolit oldat az alsó része a chip egy pipettával . Szerelje fel a chip -ra egy csavar sapkát. A twist sapka tartalmaznia kell a referencia elektród és a szívócsövet. Hozzáadása egy csepp extracelluláris elektrolit oldatban , hogy a tetején a chip egy pipettával . Az elektrolit oldat lehetővé teszi a chip, hogy az elektróda érintkezik . Adjunk hozzá 5 mikroliter sejtszuszpenziót a sóoldatot a chip . Helyezze egyetlen cellában szívó át pipettával . Szívás kézzel is elvégezhető a levegőt szívnak át a pipetta . Elhelyezése a sejt növekszik ellenállást képez tömítést. A tömítés lehetővé teszi a vizsgálatot a teljes sejt .
